近日，南方科技大学化学生物学系讲席教授廖茂富团队在Nature Communications 上发表题为“Structures of the Mycobacterium tuberculosis efflux pump EfpA reveal the mechanisms of transport and inhibition”的研究论文。该研究表明，多药外排泵A（Efflux pump A, EfpA）可能作为脂质转运蛋白，在MTB细胞内促进脂质在磷脂双层之间的翻转，并揭示了新型抑制剂在EfpA上的作用位点及其抑制机制。

结核病（TB）是一种主要由结核分枝杆菌（MTB）引起的全球性传染病。近年来，全球每年有超过1000万新发结核病例，并导致超过160万人死亡，使MTB成为全球第二大致死传染性病原体，仅次于SARS-CoV-2，超过艾滋病病毒（HIV）。耐药结核的出现和持续增加，使全球结核疫情更加严峻。

MTB耐药的机制主要有两种：一是药物靶点相关基因突变导致药物失效；二是MTB药物外排泵的激活和过表达，降低了细菌内的有效药物浓度。EfpA是首个在MTB中发现的药物外排泵，也是MTB生存所必需的。在多种临床耐药株中，EfpA过量表达使MTB对异烟肼、利福平、阿米卡星等多种药物的耐受性增加了几十甚至上百倍。最近报道的新型抗MTB抑制剂BRD-8000系列和BRD-9327，被证明能够特异性靶向EfpA。然而，目前我们对EfpA在MTB体内的功能及其抑制机制仍然了解有限。

研究团队利用冷冻电镜解析了EfpA在向外开放构象下与内源性脂质或抑制剂结合的高分辨率结构。EfpA属于转运蛋白中的Major Facilitator Superfamily（MFS）超家族，但与经典的12条跨膜螺旋的MFS转运蛋白不同，EfpA除了NTD和CTD各6条跨膜螺旋外，还具有一个连接NTD和CTD的含有两条跨膜螺旋的铰链结构域（HD）。

图1. 结核分枝杆菌EfpA结构、脂质通道以及抑制剂结合位点

有趣的是，EfpA 内部存在一个从质膜磷脂双层内叶延伸至外叶的“阶梯”型通道，其中有三个脂质分子以头对头、尾对尾的方式依次结合（A、B和C位）。分子动力学模拟表明，这些脂质分子能够稳定地结合在该通道内。在该通道中间区域，两个脂质分子的亲水头部与周围螺旋结构共同形成了一个向外开放的带负电荷的口袋。这个口袋的大小和表面电荷与 EfpA 外排的亲水性底物 EtBr 和异烟肼相匹配。

在 EfpA 与抑制剂 BRD-8000.3 结合的结构中，BRD-8000.3 取代了 A 位脂质分子，占据了 EfpA 中脂质通道的内叶脂质结合位点。这与之前报道的几种 BRD-8000.3 耐受突变株的突变位点相一致。而 BRD-9327 耐受突变则位于脂质结合位点 B 周围。通过 AutoDock 分子对接分析，BRD-9327 可以结合到脂质结合位点 B，取代该位点的脂质。BRD-9327 和 BRD-8000.3 在 EfpA 中结合的位点不同，这解释了之前报道的两者联合使用时具有的协同抑制作用。

图2. EfpA 的脂质转运模型以及小分子抑制机制

小分子占据 EfpA 中的脂质结合位点，进而抑制 MTB，这表明这些脂质与 EfpA 在 MTB 中的内在功能存在至关重要的联系。为了进一步探究 EfpA 的内在功能，研究者利用基因结构功能预测工具 COFACTOR 和 Dali 分别对数据库进行搜索，两种搜索结果一致地将 MFS 超家族中的溶血磷脂转运蛋白 MFSD2A 作为最佳匹配。尽管序列同源性较低（11%），EfpA 和 MFSD2A 在结构上表现出高度相似性。此外，B 和 C 两个脂质结合位点也彼此对应。这些发现表明，EfpA 很可能与 MFSD2A 类似，具有脂质转运蛋白的功能。

此外，研究者还比较了EfpA向外开放的冷冻电镜结构与 AlphaFold 预测的向内开放的EfpA结构，揭示了两者之间的构象变化以及脂质通道的改变。最后，他们提出了 EfpA 脂质转运的“阶梯翻转”模型，以及小分子抑制剂的作用机制。

综上所述，该研究解析了结核分枝杆菌多药外排泵 EfpA 的结构，表明 EfpA 在 MTB 中可能行使脂质转运蛋白的功能，确定了新型 MTB 抑制剂在 EfpA 内的结合位点。这些进展为靶向 EfpA 的抗结核新药研究和优化提供了结构基础，并推进了对 MFS 超家族脂质转运蛋白机制的理解。

原哈佛大学博士后王暑辉博士（现耶鲁大学）和南方科技大学廖茂富教授为本文共同通讯作者，王暑辉博士也为本文第一作者。该研究得到国家自然科学基金委的大力支持。

文章链接：https://www.nature.com/articles/s41467-024-51948-9

供稿：生命科学学院

通讯员：付文卿

编辑：周易霖