近日，南方科技大学医学院生物化学系副教授贾宁课题组在学术期刊 Nature Communications 上发表了题为“Tetramerization-dependent activation of the Sir2-associated short prokaryotic Argonaute immune system”的研究论文。该研究揭示了细菌利用新型 SPARSA 免疫系统采用独特的多聚激活模式抵御外源质粒入侵的分子机制，加深了人们对细菌免疫系统以及 Ago 系统的理解，并为开发基于 SPARSA 系统的生物技术工具奠定了坚实的理论基础。

细菌在与噬菌体的长期共进化过程中，进化出了一系列免疫系统抵御噬菌体的入侵。贾宁课题组一直聚焦于原核生物（细菌和古菌）免疫防御系统抵御噬菌体和质粒入侵的分子机制研究，近几年来揭示了包括 CRISPR 及 pAgos 系统在内的多种原核生物免疫系统抵御噬菌体和质粒入侵的分子机制（Nature Chemical Biology, 2023; Molecular Cell, 2023, 2019a, 2019b, 2019c; Nature Communications, 2024, 2022; Science, 2020; Cell Research, 2022, 2020; Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2021）。Argonaute（Ago）蛋白广泛存在于从细菌到人类的各个物种中，且参与真核生物 RNA 干扰这一重要的生理过程。近期，有研究报道原核生物中存在一类新型短Ago (pAgo) 蛋白，它们通常与一些 NADase 结构域耦联，在细菌抵御噬菌体和质粒的免疫系统中发挥了重要的作用，但其发挥作用的分子机制尚不清楚。

SPARSA (Sir2-domain associated short pAgo) 系统就是这样一类新型原核生物 pAgo 系统，它与去乙酰化酶（Sirtuin，Sir2）结构域耦联并通过Sir2结构域消耗细胞中重要的二核苷酸小分子 NAD(P)⁺ 发挥免疫作用。为探究细菌利用该免疫系统抵御质粒入侵的作用机制，课题组首先通过生理实验发现 SPARSA 系统对带有类似 ColE1 复制起点的多种外源质粒都具备防御能力，并证实了组成 SPARSA 系统的 Sir2-APAZ 和 pAgo 两种蛋白能形成稳定的异源二聚体 SPARSA 复合物（图1a, b）。该复合物在向导链 gRNA 的引导下识别入侵的外源靶标单链 ssDNA，随后形成具有 NAD(P)⁺ 降解活性的四聚体（图1b, c）。通过冷冻电镜单颗粒方法，课题组解析了非活性状态的 SPARSA^gRNA-ssDNA 单体结构以及活性状态的 SPARSA^gRNA-ssDNA 四聚体结构，揭示了 SPARSA 系统的组装、核酸识别以及 NADase 激活的分子机制。

图1 SPARSA 系统能抵御质粒入侵且被单链 DNA 诱导形成活性多聚体

同时，研究人员通过结构分析进一步发现，SPARSA^gRNA-ssDNA四聚体呈现出一种碗状的整体构象，四个 Sir2 结构域位于结构中央，而核酸双链与其它的结构域位于结构外围（图2）。与单体状态下的 SPARSA^gRNA-ssDNA 复合物相比，在 SPARSA^gRNA-ssDNA 四聚体中，四个单体可以被分为两种不同的构象，这两种构象的主要区别在于它们的 Sir2 结构域和连接 Sir2 结构域和与 APAZ 结构域的柔性区域所处的相对位置不同，表明 Sir2 结构域在 SPARSA 系统四聚化的过程中会发生重新排布。

图2 SPARSA系统四聚体的整体结构图

此外，研究人员发现 SPARSA 系统在其 pAgo 蛋白上有一段专门的柔性区域，能够检测 SPARSA 系统是否在 RNA 的引导下互补结合了单链 DNA。通过与未结合核酸状态下的 SPARSA 复合物进行结构比较，课题组发现这段柔性区域发生了显著的构象变化，且直接与 RNA-DNA 双链上的碱基发生相互作用。研究人员将这段柔性区域进行突变后，SPARSA 系统的 NAD 酶活性也被完全抑制，结果表明这段柔性区域在激活 SPARSA 系统过程中发挥了重要作用。

综上，研究人员提出了 SPARSA 系统复合物组装、核酸识别、多聚激活等过程的模型（图3），详细阐述了 SPARSA 系统在抵御质粒入侵过程中发挥作用的分子机制。这些发现加深了人们对原核生物 SPARSA 防御系统的理解，并为开发基于 SPARSA 的生物技术工具奠定了分子基础。

图3 SPARSA 系统通过核酸结合诱导多聚并发挥免疫功能的分子机制

南方科技大学医学院博士后崔宁、张峻涛为论文第一作者，贾宁为论文通讯作者，南方科技大学是论文第一单位和通讯作者单位。该研究得到了国家自然科学基金、广东省和深圳市面上自然基金、广东省重点实验室、深圳市孔雀计划等项目的大力支持。南方科技大学冷冻电镜中心为该研究相关的冷冻电镜数据收集和处理工作提供了大力支持。

论文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-024-52910-5