近日，南方科技大学医学院生物化学系、稳态医学研究院助理教授洪鑫与合作者在肿瘤学权威期刊 Cancer Discovery 在线发表题为“GPNMB Drives Brain Metastasis by Sculpting a Pathological Endothelial-Immune Interactome”的研究论文，提出 CBX3⁺GPNMB⁺ CTCs 和血浆 CXCL12 可作为脑转移患者潜在的无创液体活检标志物，并提示 GPNMB 联合 PD1 阻断可能成为脑转移精准免疫治疗的新策略。

研究围绕脑转移中循环肿瘤细胞（circulating tumor cells, CTCs）如何突破血脑屏障并重塑脑内免疫微环境这一关键科学问题，利用CTC单细胞转录组、脑转移组织空间转录组、全外显子测序、血浆蛋白组、体内外功能实验和临床样本验证，系统揭示了 CTC 分泌因子 GPNMB 通过破坏脑内皮细胞稳态、诱导血脑屏障通透性增加，并进一步通过 CXCL12-CXCR4 轴促进免疫细胞浸润和免疫抑制性脑转移微环境形成的分子机制。

脑转移是多种实体瘤晚期进展中最具破坏性的临床事件之一，常见于肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、结直肠癌和肾癌等恶性肿瘤患者。由于血脑屏障的存在，外周肿瘤细胞进入脑实质需要经历极其复杂的血管外渗过程。循环肿瘤细胞被认为是血行转移的“种子”，但真正能在血液循环中存活、黏附脑微血管、破坏血脑屏障并最终完成脑内定植的CTCs仅占极少数。长期以来，CTCs如何与脑内皮细胞相互作用，以及其如何进一步改变脑转移免疫微环境，仍缺乏系统性机制解释。本研究围绕“CTC—血脑屏障—免疫微环境”这一连续过程展开，试图从脑转移发生的早期血管进入环节到后续免疫重塑过程建立完整的机制框架。

在研究设计上，团队首先构建了脑转移患者 CTCs 和脑转移灶的多组学研究体系。研究共纳入来自60名个体的63份样本，其中包括10例团队自建脑转移患者队列；对部分患者脑转移组织和匹配 PBMC 进行全外显子测序，对4例脑转移组织进行高分辨率空间转录组分析，并对29例额外脑转移患者样本进行 bulk RNA-seq 验证。同时，团队利用先进的微流控 CTC 分离平台从7例脑转移患者外周血中获得79个 CTCs，并采用针对低活性 CTCs 优化的 Smart-seq3 方案进行单细胞转录组测序；此外，研究人员还收集了15例肺癌脑转移患者血浆用于 Olink 蛋白组分析。这一设计使研究能从“血液中的转移种子”“脑内转移灶组织结构”“血浆蛋白标志物”和“功能实验验证”多个层面交叉验证脑转移的关键机制（图1）。

研究团队发现，脑转移患者来源的 CTCs 并不完全符合传统 EPCAM 高表达的上皮型 CTC 特征，而是呈现出明显的非经典转录特征。进一步分析显示，这些CTCs可分为两个主要亚群：一类表现出髓系细胞相关转录特征，另一类呈现红系/血小板相关转录特征（图1 B-C）。尽管这些 CTCs 在 mRNA 水平上上皮标志物表达较低，但研究团队通过体细胞突变匹配、拷贝数变异推断以及多重免疫荧光验证，证明其具有明确的肿瘤细胞身份（图1 D-E）。这一发现提示，脑转移相关 CTCs 可能通过获得免疫样或血液细胞样特征来逃避免疫清除，并增强其在血液循环和脑血管微环境中的适应能力。

图1：脑转移患者循环肿瘤细胞（CTCs）的单细胞多组学特征分析

通过 CTC 高表达基因与体外血脑屏障模型分泌蛋白组的交叉分析，研究团队进一步锁定 GPNMB 为脑转移 CTCs 中显著富集、并可能参与血脑屏障破坏的关键分泌蛋白（图2A）。功能实验显示，GPNMB 过表达的肺癌 H1975 细胞或黑色素瘤 A375 细胞与脑内皮细胞共培养后，可显著加重内皮细胞管腔形成障碍和 TEER 下降；而使用靶向 GPNMB 的抗体处理后，上述内皮损伤表型得到明显恢复（图2B-C）。这些结果说明，CTC 分泌的 GPNMB 并非单纯的相关性标志物，而是促进血脑屏障通透性增加和脑内皮功能障碍的功能性驱动因子。在体内功能验证方面，研究团队建立了多个脑转移动物模型，进一步证明 GPNMB 能够促进脑内定植。利用小鼠B16黑色素瘤脑转移模型，团队发现 Gpnmb 过表达显著缩短小鼠生存时间，并显著增加全身及脑内转移负荷；而体内给予 si-Gpnmb 处理后，小鼠生存期延长，脑内转移负荷降低（图2D-G）。这些体内结果进一步证明，GPNMB 在不同肿瘤模型中均具有促进血脑屏障破坏和脑转移形成的保守功能。

图2：CTC 分泌 GPNMB 促进脑内皮细胞功能障碍与肿瘤转移

在分子机制层面，研究团队进一步揭示了 GPNMB 如何作用于脑内皮细胞。配体-受体分析和蛋白互作预测提示，GPNMB 可能与脑内皮细胞上的 EGFR 发生相互作用（图3A）；随后，Co-IP 实验验证了 GPNMB 与 EGFR 之间的物理结合（图3B）。团队进一步机制研究发现，GPNMB 刺激可降低 EGFR 蛋白稳定性，并促进 CBL 介导的 EGFR 泛素化和降解（图3C-D）。研究团队还发现 EGFR 对血脑屏障的维持作用与 m6A RNA 修饰通路密切相关。脑转移内皮细胞中 m6A 去甲基化酶 FTO 显著下降（图3E），而 EGFR 敲低可降低 FTO 表达并增加 m6A 甲基化水平（图3F-G）。MeRIP-seq 和RIP实验进一步证明，FTO可直接影响 TJP1 mRNA 的 m6A 修饰水平并维持其表达稳定性（图3H-I）。同时，m6A 阅读蛋白 YTHDF2 可结合 TJP1 mRNA 并促进其降解（图3J）；敲低 YTHDF2 能挽救 FTO 缺失导致的 TJP1 下降和内皮功能障碍（图3K-L）。因此，本研究建立了“GPNMB-EGFR-FTO-YTHDF2-TJP1”这一完整分子轴，解释了 CTC 分泌 GPNMB 如何通过 RNA 表观转录组机制破坏血脑屏障。

图3：GPNMB 通过抑制 EGFR-FTO-TJP1 轴促进脑血管内皮损伤

本研究更重要的发现是：GPNMB并不是单纯促进肿瘤细胞“进脑”，还会进一步重塑脑转移免疫微环境。团队发现，在脑转移患者 bulk RNA-seq 数据中，GPNMB 表达特征与T细胞浸润、效应T细胞和耗竭T细胞特征呈正相关（图4A）。通过对4例脑转移组织进行高分辨率空间转录组分析，研究团队发现 PECAM1⁺ 内皮细胞与三级淋巴结构相关免疫细胞，包括T细胞、B细胞和浆细胞，在空间上高度邻近（图4B）；mIHC 进一步验证了脑转移灶中异常血管结构附近存在免疫细胞聚集现象（图4C-D）。这一结果说明，脑转移中异常脑内皮细胞可能不仅是被动受损的屏障结构，而是主动参与免疫细胞招募和局部免疫微环境塑造的重要节点。进一步的配体-受体分析显示，CXCL12-CXCR4 信号轴在脑转移组织中持续富集（图4E）。体外功能实验进一步证明，GPNMB 处理脑内皮细胞可刺激 CXCL12 分泌；使用抗 GPNMB 抗体 CDX-011 或 CXCL12 抑制剂 NOX-A12 后，脑内皮细胞招募 CD3⁺ T细胞和 CD19⁺ B 细胞的能力显著下降，CXCR4⁺ 免疫细胞的募集也被明显抑制（图4F）。在脑转移患者血浆样本中，免疫浸润较高的患者血浆CXCL12蛋白水平显著高于免疫浸润较低的患者，提示血浆 CXCL12 可能作为评估脑转移免疫浸润状态的潜在无创标志物（图4G）。

图4：脑转移异常内皮细胞通过 CXCL12-CXCR4 轴促进免疫细胞浸润

基于上述发现，研究团队进一步评估了靶向 GPNM B与 PD1 免疫检查点阻断联合治疗脑转移的潜力。在LLC构建小鼠肺癌脑转移模型中，Gpnmb 过表达显著增加全身肿瘤负荷和脑转移形成；体内沉默 Gpnmb 可显著抑制脑转移的发生。相较于 Gpnmb-OE 组和T1单药组，抗PD1抗体联合 si-Gpnmb 的双重治疗可进一步增强体内抗脑转移效果（图5A-F）。与阴性对照组相比， Gpnmb-OE 组小鼠脑内总 CD31⁺ 内皮细胞水平显著升高，但 CD31⁺Cdh5⁺ 内皮细胞比例明显下降，提示脑组织微血管结构严重受损（图5G-H）。抑制 Gpnmb 表达可修复脑组织内皮完整性，并降低 CD8⁺ T 细胞的浸润水平（对比 NC 组、OE 组和 T1 组）（图5I-K）。

图5 LLC 体内脑转移模型证实 GPNMB 联合 PD1 阻断治疗效果显著

综上，本研究揭示了脑转移过程中 CTCs 通过分泌 GPNMB 破坏血脑屏障并重塑脑内免疫微环境的连续分子机制。CTC 来源的 GPNMB 结合脑内皮细胞 EGFR，促进 CBL 介导的 EGFR 泛素化降解，进而抑制 FTO 表达，并通过 YTHDF2 依赖的 TJP1 m6A 调控破坏内皮紧密连接。同时，GPNMB 诱导的异常脑内皮细胞通过 CXCL12-CXCR4 轴促进免疫细胞进入脑转移微环境，并形成具有免疫抑制特征的病理性血管-免疫互作网络。该研究不仅为理解 CTCs 如何跨越血脑屏障、完成脑转移定植提供了新的理论框架，也提出 CBX3⁺GPNMB⁺ CTCs 和血浆 CXCL12 可作为脑转移患者精准分层和免疫治疗响应预测的潜在液体活检指标。GPNMB 与 PD1 的联合阻断在动物模型中显示出增强的抗脑转移效果，为脑转移患者的精准免疫治疗提供了全新的思路。

机制示意图 

南科大22级博士研究生刘雪飞、中南大学湘雅医学院神外主治医师谭军、中山大学肿瘤防治中心23级博士研究生吴纯（南科大访问学生）、南科大22级硕士研究生黄官印、中山大学肿瘤防治中心24级博士研究生程一昕（南科大访问学生）为该论文的共同第一作者。洪鑫、深圳市儿童医院文飞球教授、中南大学湘雅医学院神外刘庆教授、中山大学肿瘤防治中心鼻咽科刘赛兰教授、空军军医大学西京医院李春英教授和郭伟楠教授为该论文的共同通讯作者。南方科技大学为论文第一单位和最后通讯作者单位。该研究获得了国自然基金、广东省自然基金以及南科大医学院-上医健联合实验室等项目的资助。

文章链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41973996/

供稿：生物化学系

通讯员：杨玲

主图：丘妍

编辑：曾昱雯