近日，南方科技大学环境科学与工程学院夏雨副教授团队与合作者在 Nature Water 发表了题为“Coupling filter mating with nanopore selective sequencing expands capturable conjugative plasmid recovery in biological wastewater treatment systems”的研究论文。研究团队将滤膜接合法与纳米孔选择性测序技术相结合，无需单独提取质粒DNA，即可在总DNA中直接富集污水处理系统中的可接合耐药质粒，显著拓展了可捕获耐药接合质粒的识别范围，为追踪耐药基因的潜在传播提供了新方法。

污水处理厂汇集了来源多样的微生物，是耐药基因交换的热点场所。接合质粒能够携带耐药基因在细菌间转移，解析其组成与分布，是理解污水处理过程中耐药基因传播的重要基础。然而，常规质粒提取易因提取偏差和试剂盒偏好产生偏倚，低丰度质粒又常被海量染色体序列淹没，使得部分具有转移潜力的质粒难以被充分捕获识别。

针对这一挑战，研究团队将滤膜接合的定向捕获能力与纳米孔选择性测序的实时读段筛选能力结合，建立滤膜接合与纳米孔选择性测序联用流程（FM-NSS）：以荧光标记的大肠杆菌作为受体，通过滤膜接合法捕获污水菌群中真实发生转移的接合质粒，再利用纳米孔选择性测序实时弹出受体细胞基因组读段，从而在总DNA中直接富集目标质粒，省去了单独提取质粒DNA的步骤。研究将该流程应用于深圳一座市政污水处理厂的进水、厌氧污泥、缺氧污泥和活性污泥样本，并结合质粒分型与抗性基因注释开展分析。

图1. FM-NSS研究流程。以污水微生物群落为供体、带绿色荧光标记的大肠杆菌为受体开展滤膜接合，筛选并汇集阳性接合子后提取总DNA；通过纳米孔选择性测序减少受体染色体读段，获得用于质粒组装的长读段。同时设置质粒提取测序与细胞内外DNA宏基因组测序，用于方法比较和生态分析

研究获得约110万条质粒测序读段，组装得到622条非冗余质粒序列，平均长度为24.21 kb，最长达到202.80 kb；其中441条序列未被同一接合子池的常规质粒提取测序流程检出，在覆盖原有可检出序列的基础上进一步扩展了回收范围。

图2. 不同测序流程对质粒序列的检出情况。（a）FM-NSS长读段与质粒提取短读段的覆盖度比较；（b）不同检出类别的序列数量；（c）两类测序数据对组装质粒序列的比对比例；（d）622条非冗余质粒序列在不同处理阶段及测序数据集中的分布。LR表示长读段，SR表示短读段；Inf、AnaS、AnoS和ActS分别表示进水、厌氧污泥、缺氧污泥和活性污泥

研究人员进一步分析发现，不同处理阶段的可捕获质粒在组成和功能上呈现差异：研究识别出440条在四类样本中均检出的核心质粒序列，以及32条仅在活性污泥中检出的序列，活性污泥中的独特质粒谱与较高的预测微生物生长潜力相伴出现。研究还从质粒群体层面解析了移动性分型、不相容群与抗性基因的关联：375个质粒可依据复制子序列归入具体不相容群，关联网络显示MOBQ与多类抗性基因具有较广泛联系，IncP型质粒与OXA-58、TEM-176等β-内酰胺类抗性基因存在较强关联。

图3. 不同生物处理阶段的质粒组成及功能特征。（a）质粒序列的共享与特有分布；（b）不同质粒组分的MOB类型与不相容群构成；（c–e）功能注释及部分通路相关基因分布；（f）质粒序列与细菌基因组的高重叠比对情况；（g、h）微生物预测生长潜力及相关比对特征。疾病相关通路标签属于序列功能注释，不等同于检出相应病原体或证实致病能力

图4. 质粒移动性分型、不相容群与抗生素抗性基因的关联。（a）三类遗传特征的关联概览；（b、c）MOB类型和不相容群的数量分布；（d）不同抗性基因类别的数量及平均拷贝数；（e、f）不相容群、MOB类型分别与抗性基因亚型之间的统计关联网络。网络连线表示所分析质粒序列中的关联，不代表已直接验证的转移路径

该研究把实验可捕获性与选择性测序衔接起来，在减少染色体背景对测序资源占用、省去单独提取质粒DNA环节的同时，识别出更多常规流程容易遗漏的质粒序列，为追踪污水处理系统中的可移动耐药遗传元件提供了更丰富的序列基础。需要说明的是，FM-NSS所获得的是经过筛选的可捕获质粒组分，其范围受滤膜接合条件、受体兼容性及筛选条件共同影响，不等同于污水环境中的全部质粒。

论文第一作者为南方科技大学与哈尔滨工业大学联合培养博士颜玉玺，论文通讯作者为夏雨，南方科技大学为论文第一单位。该研究获得广东省基础研究重大项目、国家自然科学基金、深圳市科技计划等项目的支持，南方科技大学超算中心及公共研究平台为研究提供了计算资源支持。

论文链接：DOI：10.1038/s44221-026-00695-w

供稿：环境科学与工程学院

通讯员：周亦潆

主图：丘妍

编辑：曾昱雯