近日，南方科技大学医学院田瑞琳助理教授团队在神经科学领域学术期刊 Neuron 在线发表题为“Mapping cell-type- and age-dependent neuronal vulnerability through genome-wide in vivo CRISPRi screens in the mouse brain”的研究论文。该研究建立了一套可扩展、具有细胞类型分辨率的小鼠脑内全基因组 CRISPRi 筛选平台，并在4类神经元群体和3个年龄阶段开展系统性体内遗传筛选，绘制神经元生存相关基因的功能图谱。

研究发现了一批在传统体外模型中未能识别、但对体内神经元生存至关重要的基因，进一步鉴定出269个神经元核心必需基因，并揭示了兴奋性与抑制性神经元之间，以及不同年龄阶段神经元之间的易感性差异。

图1. 文章图形摘要

目前，神经系统中的大规模 CRISPR 筛选仍主要依赖体外培养模型。尽管 iPSC 来源神经元等模型极大推动了神经疾病功能基因组学研究，但培养环境与真实脑组织存在本质差异：培养基中的营养物质和抗氧化成分可能缓冲细胞压力，同时体外体系难以完整重现神经元亚型多样性、神经元—胶质细胞互作以及衰老过程。为解决这些问题，研究团队将 AAV-PHP.eB 介导的广泛脑内递送、条件性 CRISPRi 小鼠、细胞类型特异Cre品系小鼠以及 DIO-sgRNA 载体进行整合，建立了细胞类型特异的体内 CRISPRi 筛选体系。

图2. 小鼠脑内高通量 CRISPR 筛选策略

团队分别构建了包含1,450个神经退行性疾病相关基因的靶向文库以及覆盖11,392个神经元表达基因的全基因组级文库，首先在 Syn1 标记的泛神经元中进行了筛选。筛选中生物学重复之间表现出较高一致性，全基因组筛选单个重复 ROC-AUC 达到 0.93–0.97，表明该体系能够在小鼠脑内开展高覆盖度、可重复的大规模遗传筛选。随着观察时间延长，越来越多影响神经元生存的基因逐渐显现；这些基因显著富集于RNA聚合酶、剪接体、蛋白酶体、RNA运输和氨酰 -tRNA 合成等基本生命过程，同时也富集于突触囊泡循环以及ALS等神经系统疾病相关通路。更为关键的是，研究人员体内筛选发现了一批在传统体外筛选中未表现出明显表型、但对体内神经元生存至关重要的基因，其中一个典型例子是铁死亡关键调控因子 Gpx4。Gpx4 在小鼠脑内筛选中表现出显著的生存必需性，神经元特异敲低 Gpx4 可导致严重神经毒性；但在标准培养条件下的人 iPSC 来源神经元中，GPx4 敲低几乎没有明显生存表型。进一步实验表明，培养基中的抗氧化成分能够显著改变 Gpx4 敲低的表型，说明人工培养条件可能掩盖部分基因在体内环境中对神经元生存的重要作用。

在此基础上，研究团队进一步将筛选拓展至不同神经元群体。除了 Syn1 标记的泛神经元外，还在 Emx1标记的海马和皮层兴奋性神经元、Vglut2 阳性兴奋性神经元以及 Vgat 阳性抑制性神经元中进行了并行筛选。通过整合4类神经元的全基因组筛选结果，研究人员定义了由269个基因组成的神经元核心必需基因集（neuronal core essential genes），其中66个为神经元特异的核心必需基因。

通过平行比较不同神经元类型的筛选结果，研究团队发现，基因的表达水平并不能简单预测其功能重要性。即使一个基因在不同细胞类型中的表达量相近，其敲低产生的生存表型也可能截然不同。研究人员重点验证了两个敲低后在不同神经元类型中产生显著不同生存表型的基因：Exosc9 敲低显著影响 Vgat 阳性抑制性神经元的生存，而对 Vglut2 阳性兴奋性神经元影响较弱；Ostm1则呈现相反的细胞类型特异性，其敲低主要影响 Vglut2 阳性兴奋性神经元的生存。这一结果说明，选择性神经元易感性并不一定能够从静态的基因表达差异中直接推断，这也为理解神经退行性疾病中的选择易感性提供了新的研究框架。

图3. 小鼠脑内CRISPRi筛选鉴定体内神经元必需基因以及细胞类型选择易感因子

体内筛选相比体外体系的另一项重要优势，是能够直接研究生理性衰老过程中基因功能的变化。研究团队进一步将全基因组筛选延长至衰老阶段，并在18月龄和20月龄小鼠中开展长期筛选。结果显示，随着年龄增加，神经元对基因功能扰动变得更加敏感。与此同时，多数在早期筛选中鉴定出的必需基因，在衰老阶段仍表现出稳定的生存表型。尤其值得注意的是，研究鉴定出大量衰老特异性必需基因，显著富集于线粒体翻译、氧化磷酸化、胞质翻译以及核糖体生物发生等通路。进一步与人脑衰老单细胞转录组数据整合后，研究人员发现，其中65个衰老特异性必需基因在人类衰老脑中也呈现差异表达，且均随年龄增长而下调，并同样集中于翻译和线粒体相关功能。这些结果提示，随着衰老过程中线粒体功能和蛋白质合成能力逐渐下降，神经元可能更难耐受对这些基础细胞过程的进一步扰动。

图4. 衰老特异性必需基因显著富集于线粒体、胞质翻译相关通路

为了方便研究人员进一步利用这些体内筛选数据，研究团队还建立了 CRISPRinvivo 在线数据平台。该平台整合了本研究获得的脑内 CRISPR 筛选结果以及部分已发表的其他体内筛选数据。

总体而言，该研究建立了一套能够在完整小鼠脑中开展全基因组、细胞类型特异的体内 CRISPRi 筛选体系。这些结果从神经元核心必需基因、细胞类型特异性以及衰老相关变化等多个层面，初步描绘了神经元基因功能与选择性易感性的体内图谱。该平台未来可进一步扩展至多巴胺能、胆碱能和运动神经元以及胶质细胞等多种细胞类型，并结合疾病模型、诱导型扰动系统、单细胞和空间组学，从而逐步构建更加完整的脑内基因功能图谱。

南方科技大学医学院博士生林日昇为论文第一作者，田瑞琳为论文通讯作者，南方科技大学为论文第一单位。南方科技大学医学院硕士生柯泽婷、博士生王建慧、博士后魏天资、访问学生张立夫以及本科生方奕童为研究做出重要贡献。本研究得到国家重点研发计划、国家自然科学基金、广东省基础与应用基础研究基金、深圳市医学研究专项资金以及深圳市基础研究相关项目的支持。

原文链接：https://www.cell.com/neuron/abstract/S0896-6273(26)00615-X

供稿：医学院

通讯员：田新新

主图：丘妍

编辑：曾昱雯