近日，南方科技大学生命科学学院生物系副教授翟继先团队开发了一种不经过原生质体直接检测植物单细胞核全长转录组测序方法，相关成果以“FlsnRNA-seq: protoplasting-free full-length single-nucleus RNA profiling in plants”为题发表在基因组学领域知名学术杂志Genome biology上。

图1. FlsnRNA-seq流程图。首先，通过研磨的方法从组织样本中分离出细胞核，通过10x Genomics建库方案构建RNA文库，获得全长cDNA并进行扩增后，将DNA分成两半。一半用于常规的二代文库构建并Illumina测序，另一半用于Nanopore长片段测序。

近年来，高通量单细胞转录组测序技术已广泛应用于动物细胞研究，但在植物物种和组织研究中少有报道。由于植物细胞比动物多了一层细胞壁，植物单细胞RNA-seq必须先消化细胞壁并制备原生质体。而原生质体的制备对于许多组织都非常困难，且制备过程会影响细胞的转录状态而引入不必要的干扰。因此，一种无需原生质体化的方法对于单细胞测序技术在植物领域中更广泛的应用必不可少。

课题组之前对新生RNA全基因组水平的研究发现，细胞核中有大量已经多聚腺苷酸化的信使RNA依然与染色质相结合。那么细胞核中的RNA能否表征整个细胞的转录状态呢？ 此外，基于Illumina平台的二代单细胞测序往往只能捕获基因的表达丰度，那么与全长转录组测序技术相结合的单细胞全长测序能否利用RNA剪接、可变多聚腺苷酸化等导致的同源异构体信息来辅助细胞类型鉴定并挖掘出更多信息呢？

为回答这些问题，并突破原生质体的限制，优化植物单细胞测序技术，翟继先团队提出基于细胞核测序的全长单细胞转录组测序方法FlsnRNA-seq（protoplasting-free full-length single-nucleus RNA profiling in plants）。此方法通过结合10x Genomics单细胞测序技术和三代全长Nanopore测序方法实现了单细胞核全长转录组测序。同时利用Illumina测序技术捕获表达丰度信息，并以Nanopore测序技术捕获同源异构体信息，从而最大限度地保留单个细胞核的转录状态（图1）。

首先，研究团队分离了拟南芥根尖细胞核并验证了FlsnRNA-seq方法的有效性。二代测序方法得到的基因表达丰度信息可将捕获到的细胞核分为14个细胞簇。研究团队利用组织特异基因对这些细胞簇进行注释，鉴定到了10种主要细胞类型（图2）。将FlsnRNA-seq单核测序结果与已发表的单原生质体测序结果比较发现，两种方法所获得的结果相似，这说明植物细胞核可以取代原生质体进行单细胞转录组分析。此外，Nanopore文库所捕获的基因表达丰度矩阵与Illumina文库高度相似。将Nanopore文库所捕获的同源异构体信息与Illumina文库的表达丰度信息结合，可以对细胞类型进行更细致的分类和注释。

图2. FlsnRNA-seq可以捕获拟南芥根尖组织中的多种细胞类型。利用UMAP降维并可视化单细胞核测序所获得的基因表达丰度信息。（图中细胞的颜色代表不同的细胞簇）

为了验证FlsnRNA-seq方法的普适性，研究团队还对拟南芥的心形期胚乳进行了测序分析。通过细胞聚类和注释后，研究团队鉴定到了6个细胞簇，涵盖了前人报道过的所有胚乳细胞类型。此外，通过分析Nanopore数据，在以珠孔端胚乳为主的细胞簇中，研究团队发现mRNA的未剪接比例明显高于其他细胞类型，这说明借助全长单细胞技术可以得到传统二代方法难以捕获的细胞基因转录和剪接信息（图3）。该方法极大拓展了植物单细胞RNA-seq的使用，使单细胞测序技术大规模应用于植物成为可能。

图3. FlsnRNA-seq可以识别拟南芥胚乳中不同簇中内含子剪切的差异。（左图）利用UMAP降维并可视化单细胞核测序所获得的基因表达丰度信息（细胞的颜色由Nanopore测序技术所获得的未完全剪接的转录本的比例所决定）。（右图）细胞的未完全剪接转录本比例在不同细胞簇中的分布情况。

 翟继先课题组研究助理教授龙艳萍、博士生刘智剑和研究助理教授贾津布为该论文共同第一作者，翟继先为论文的通讯作者，南科大为唯一通讯单位。南科大生命科学学院讲席教授陈炜和研究副教授方亮也参与了该研究工作。该研究得到了科技部国家重点研发计划、广东省创新创业团队、深圳市科创委以及广东省植物细胞工厂分子设计重点实验室基金的资助。

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供稿单位：生物系

通讯员：付文卿

编辑：吴一敏

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